Fondata da Federico Borromeo nel 1618 nei pressi della Biblioteca Ambrosiana, l'istituzione nacque di sussidio e di modello a una futura Accademia di Belle Arti per la formazione e l’educazione del gusto estetico, in conformità ai dettami del Concilio di Trento.

Alla Pinacoteca fu infatti affiancata, fin dal 1621, un'accademia di pittura e scultura. Oggi la Pinacoteca conta 24 sale che seguono un percorso cronologico che dalla collezione federiciana giunge al primo Novecento. Si contano più di 1.500 opere su tavola, su tela e su rame. Fanno parte della collezione 248 disegni di vari maestri tra cui Raffaello, del quale si conserva il grande cartone per la Scuola d’Atene, e Leonardo, del quale è conservato il Codice Atlantico (1750 disegni di carattere tecnico-scientifico).

Tra i dipinti più famosi della Pinacoteca Ambrosiana vanno segnalati: il Musico di Leonardo, la Canestra di frutta di Caravaggio, il Ritratto di dama di Giovanni Ambrogio De Predis, la Madonna del padiglione di Botticelli, il Presepe di Barocci, l’Adorazione dei magi di Tiziano, la Sacra Famiglia di Bernardino Luini, il Fuoco e l’Acqua di Brueghel.