Il soggetto di Giuditta che decapita Oloferne è uno degli episodi dell'Antico Testamento più frequentemente rappresentati nella storia dell'arte. Tuttavia - con la sola importante eccezione di Giuditta e Oloferne del Caravaggio conservata a Roma, nella Galleria nazionale d'arte antica - mai si è giunti a raffigurare una scena così cruda e drammatica come quella dipinta in questa tela di Artemisia Gentileschi. L'episodio al quale si riferisce l’opera è narrato nel Libro di Giuditta: l'eroina biblica, assieme ad una sua ancella, si reca nel campo nemico; qui circuisce e poi decapita Oloferne, il feroce generale nemico. Il quadro - di soggetto perfettamente analogo a quello della tela, un po' più piccola e dai diversi colori, eseguita in precedenza e conservata oggi nel Museo Capodimonte di Napoli con lo stesso titolo – è quello che più immediatamente si associa al nome della Gentileschi. L'analisi del quadro, in chiave psicologica, ha portato alcuni critici contemporanei a vedervi il desiderio femminile di rivalsa rispetto alla violenza sessuale subita da parte di Agostino Tassi.