Si formò con dei pittori giotteschi a Forlì e fu influenzato dall’arte di Mantegna portata in città da Ansuino da Forlì che lavorò a Padova. Dal maestro veneto derivò l’illusionismo prospettico, facendo degli scorci dal basso una sua cifra stilistica.
Giunse a Roma nel 1464, dove dipinse nella Basilica di San Marco e, con Antoniazzo Romano, nella cappella del cardinal Bessarione ai Santi Apostoli.  Dal 1465 si trasferì a Urbino, dove divenne seguace di Piero della Francesca e, probabilmente, collaborò alla serie di uomini illustri per lo Studiolo di Federico da Montefeltro. Dopo dieci anni fece ritorno a Roma, assumendo il ruolo di pittore ufficiale di Sisto IV per il quale realizzò diversi capolavori tra cui la celebre scena con Sisto IV affida la Biblioteca Vaticana a Bartolomeo Platina (1477, Pinacoteca Vaticana) e gli Angeli musicanti per la chiesa dei Santi Apostoli (1480), commissionati dal cardinal nepote del pontefice, Giuliano della Rovere. Quest’ultima impresa resta il massimo capolavoro di Melozzo, la cui resa prospettica fu tenuta presente persino da Michelangelo per la Sistina. Distrutta l’abside nel 1711, gli affreschi vennero divisi in 16 frammenti: il Cristo benedicente è sullo scalone del Palazzo del Quirinale, un angelo al Museo del Prado, gli altri 14 in Pinacoteca Vaticana.
Nel 1478 fu tra i fondatori della nuova Università dei Pittori. Nel 1484, morto Sisto IV, partì per Loreto dove affrescò la Cupola della Sagrestia di San Marco nella Santa Casa di Loreto. Nel 1489 tornò a Roma e realizzò il mosaico con Gesù e gli evangelisti per la cappella di Sant’Elena in Santa Croce in Gerusalemme.